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下面的分享中将介绍Orbitrap质谱上对8 种小分子药物进行鉴定，并对谱图准确度鉴定分子式的准确度进行评估。

1. 实验方法

2. 数据分析

将从Orbitrap 获取的所有质谱数据导入MassWorks（Cerno Bioscience, Norwark, CT）软件，进行 sCLIPS（自校准线形同位素轮廓搜索）分析。sCLIPS 仅对峰形进行校准，以测量得到的单同位素峰为校准标准，将实际峰形函数转化为已知的数学函数。将其应用于未知离子的整个同位素轮廓时，会转化为具有相同已知峰形函数的校准同位素轮廓，随后用于计算任何给定候选分子式的理论质谱图，从而实现具有高谱图准确度（SA）的精确同位素建模。

图1：MassWorks中sCLIPS的分子式鉴定流程

3. 结果与讨论

3.2 谱图准确度的作用：

谱图准确度已被证实在通过峰形校准确定元素组成的过程中，是排除假阳性分子式的有力指标。谱图准确度方法与其他方法的根本区别在于，该方法使用校准后的轮廓质谱图，进行精确的同位素建模，而其他方法要么采用过于简化的棒状（质心）质谱图，要么使用假定峰形函数的轮廓质谱图。先前研究表明，对于一组分子量大于 800 amu、质量误差为 2 ppm 的化合物，基于谱图准确度可排除高达 99% 的错误分子式。针对分子量小于 500 amu 的小分子的研究，也取得了类似结果。

八种化合物在通过峰形校准后的获得了高的谱图准确度，并成功将全部的分子式鉴定为排名第一或第二的结果，具体总结在图2中。所有检索均在非常宽松的条件下进行，涵盖了大多数常见元素，且对其上下限没有任何限制。若没有谱图准确度的辅助，要明确鉴定这些小分子将极具挑战。

图2：谱图准确度鉴定8个化合物的分子式的结果

3.3 泼尼松的鉴定

以泼尼松（Prednisone）的分子式检索为例， 其[M + H]离子的正确分子式 C₂₁H₂₇O₅，在总共 44 个候选分子式中排名第一。图 3 展示了排名前四的分子式及其精细同位素结构，以说明谱图准确度在鉴定真正未知化合物方面的强大作用。真正的泼尼松分子式，含有碳、氢、氧元素，其 A+1 峰主要由 ¹³C 贡献，占比 23.5%；A+2 峰则由 ¹³C¹³C 和 ¹⁸O 贡献，占比 2.9% 。理论计算质谱图（黑色）与校准质谱图（红色）之间，泼尼松具有高度匹配的同位素模式，这从其较高的谱图准确度可以看出。排名第三和第四的分子式均含有氮原子，导致出现两个不匹配的情况，使得谱图准确度远低于排名第一的结果。第一个不匹配源于 A+1 峰，由于分子中碳原子较少；同时，C₁₈H₂₇N₂F₃P 和 C₁₇H₂₃N₄F₄引入了第二个不匹配，因为实际化合物中不存在这样的峰。虽然主要的谱图误差来自 A+1 峰，但 A+2 峰也存在明显差异。

图3：泼尼松的精细同位素结构分析

4. 结论：

1）大多数被研究的化合物，其分子式在MassWoks软件中的谱图准确度可达到或接近 98%。

2）谱图准确度为成功鉴定未知化合物的分子式，提供了一种独特且有效的方法。凭借谱图准确度，所有化合物都被正确鉴定为排名第一或第二的结果。

2）对于大多数实际药物杂质的鉴定，仅 3ppm 的质量精度，不足以实现高可信度的鉴定。而基于利用同位素精细结构对质谱峰形进行校准，能够可靠地鉴定真正未知物的分子式。