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浙江大学用户与台湾中兴大学再次合作，在Rapid Commun. Mass Spectrom上发表文章《 Identification of new minor metabolites of penicillin G in human serum by multiple-stage tandem mass spectrometry》，采用MassWorks在四极杆质谱上测定了青霉素G的8种新代谢产物的质量数，并对血浆中微量代谢物进行了确证。

多级质谱确证人血清中青霉素G新的微量代谢产物

Hsin-Pin Ho¹, Ren-Jye Lee¹, Chung-Yu Chen¹, Soo-Ray Wang², Zu-Guang Li1,³

and Maw-Rong Lee¹*

1  Department of Chemistry, National Chung Hsing University, Taichung 40227, Taiwan, R.O.C.

2  Department of Interncel Medicine, Chung Shan Medical University and Chung Shan Medical University Hospital,

Taichung 40201, Taiwan, R.O.C.

3  College of Chemical Engineering and Materials Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014  Zhejiang, P.R. China

摘要：液相色谱质谱和液相色谱串联质谱法常被用于药物代谢物的研究。虽然这两种方法已经解决了代谢物鉴定及结构表征的分析，但是仍然是比较耗时的。本文中，一种新的多级串联质谱方法用于人血清中青霉素G的微量代谢产物-一种β-内酰胺抗生素的鉴定及结构表征的分析。青霉素G的七种微量代谢产物包括5种I相代谢产物和2种II相代谢产物通过应用LC-MSⁿ数据分析方法而得到确证。青霉素G的七种代谢产物的质量数通过质谱校正软件（MassWorks）得到确证。本文的LC-MSⁿ数据分析方法能够在代谢分析中提供微量代谢产物的丰富的、必要的结构信息。

前言

略

实验

化学试剂

所有化学试剂均为分析纯，青霉素G（99.7%）购自Riedel-deHae¨n（Sseelze，德国）。青霉素G的代谢产物青霉噻唑盐购自Sigma-Aldrich（St.Louis,MO,USA）.色谱级的甲醇、乙腈、甲酸购自Merck（Darmstadt，德国）。用水为经过Milli-Q（大于18.2MΩ，Millipore，法国）净化的超纯水。青霉素G和青霉素噻唑盐储备液（1000 ug/ml）用高纯水制备。青霉素G和青霉素噻唑盐的混合工作液（100 ug/ml）用超纯水稀释到相应的浓度。储备液储存在0℃冰箱中。

体内血清样品的制备

略

色谱条件

液相色谱分离系统为LC1100（安捷伦科技，Santa Clara，CA,USA）带有二元泵和在线脱气装置。Phenomenex Luna C18柱和C18 预柱用于液相分离，流速为0.2 ml/min。流动相为0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）。进样量5 ul，梯度洗脱程序如下：

质谱条件

LTQ-线性离子阱质谱仪（Thermo，San Jose，CA,USA）带ESI离子源。将青霉素G和青霉素噻唑盐以10 ul/min的流速经流动注射泵直接注入ESI源得到质谱调谐条件，流动相为40%A，流速为0.2 ml/min，经T型管路与流动注射连接。优化的离子化及离子传输条件如下：鞘气流速为29arb，辅助气流速为5arb，喷雾电压为正离子模式4kv，毛细管温度为275℃，毛细管电压为41V，透镜电压为125V。在多级串联质谱中，质谱分析的参数如下：分离宽度为3.00Th，碰撞能量为25%，Q为0.25，激活时间为30ms。

数据分析条件

为了得到足够的结构信息，同时减少数据采集，设置LTQ的条件如下：（1）执行数据分析的筛查，对代谢产物进行检测；（2）设置选择性数据分析扫描方法；（3）得到母离子和中性丢失离子数据对代谢产物进行确证；（4）解析LC/MSⁿ数据。

一个四项扫描设计用于数据分析的扫描。质谱扫描中，个扫描事件为全扫模式，扫描范围为148-1000m/z，第二个扫描事件为相关产物离子的MSⁿ扫描，通过动态排除得到高于预设强度的大量的质谱峰。动态排除的参数为：重复3次，重复持续时间为30，排除列表的大小为100，排除持续时间为30。根据初步的数据分析，有针对的数据分析扫描能够得到目标代谢物的更多结构表征信息。

经过有针对性的数据分析扫描，在Xcalibur软件中多级质谱的色谱图上可以得到母离子和中性丢失离子的数据。母离子数据通过在MS2上提取特定的碎片离子而得到，中性丢失离子数据也是通过在MS2上提取中性丢失离子而得到。

质量数评估

开始采集数据前，进一针5ug/ml的包括青霉素G、青霉素噻唑盐、土霉素和玉米黄素的混合校正溶液。得到的轮廓图数据应用MassWorks软件（Serno,Bioscience,Monmouth）对不对称峰形和质量数进行校正。接着进实际样品。同样，LC/MS方法得到的轮廓图数据也应进行峰形和质量数的校正。后，基于质量数和谱图准确度得到所有可能的分子式。

结果讨论

青霉素G和青霉素噻唑盐的碎片

略

体内代谢分析

略

质量数测定

单位质量分辨率质谱对定性分析仅提供粗略的质量确证，因此需要质量数测定。本文采用MassWorks软件确证检测的代谢产物的分子式。结果如表2所示。质量误差小于25.5mDa。质量精度在96.1%-99.2%范围内。由于外部校正的应用和可能的空间效应对离子阱的影响，目标代谢产物的质量误差仅能控制在50 mDa内。良好的同位素轮廓图校正提供的信息能够对目标物分子式进行确证。

表2 青霉素G及其代谢物的质量数

青霉素G的代谢途径

    略

实际样品检测

略

结论

略。

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